ГЛАЗ И СОЛНЦЕ, ИЛИ ФОТОХИМИЯ ЗРЕНИЯ

М.А.ОСТРОВСКИЙ, академик РАН, доктор биологических наук

"Глаз нельзя понять, не зная Солнца. Вот почему глаз солнечен, по словам поэта" - так заканчивает свою замечательную книгу "Глаз и Солнце" академик С.И.Вавилов. Напечатанная впервые в 1927 году, она выдержала более десяти изданий и до сих пор остается лучшим популярным рассказом о переплетении судеб двух наук — физиологии зрения и физики света. На современном витке спирали познания метафора "солнечность глаза" наполнилась еще более глубоким смыслом. В чем же его "солнечность"?

Именно благодаря Солнцу (точнее, спектру его испускания) сформировались спектральные характеристики светочувствительных зрительных пигментов, запускающих процесс зрения. Поэтому та часть солнечного излучения, которую мы видим, и названа "видимым светом".

Наименьшая порция света — квант. В ходе биологической эволюции зрительная клетка достигла предела чувствительности, допускаемого квантовой теорией света. Палочки (клетки, ответственные за сумеречное зрение у позвоночных животных и человека) могут ответить сигналом всего на один поглощенный квант. Получается цепочка: один квант — поглотившая его молекула зрительного пигмента — одна возбужденная клетка сетчатки (палочка) — зрительный сигнал. Но чтобы распознать еле заметную вспышку света, одного кванта недостаточно. Нужно около 10—20 квантов, тогда сигналы от 10—20 палочек суммируются и передаются в мозг, в его зрительные центры. Благодаря этому механизму человек способен различать на ночном небе очень слабые звездочки — шестой, а в некоторых случаях даже седьмой и восьмой величины. Доходящий от звезд до Земли свет — это всего лишь 10-12—10-14 от полного солнечного света. Таким образом, наша зрительная система (глаза и мозг) может эффективно работать в огромном диапазоне освещенностей — от почти полной темноты до яркого солнечного дня.

Глаз животных и человека как нельзя лучше приспособлен для восприятия именно естественного солнечного света, который и сформировал "под себя" органы зрения всех животных - от самых примитивных беспозвоночных до высших позвоночных.
Вот почему глаз и в самом деле солнечен!

Зрительный пурпур, он же родопсин

Пурпур — цвет величественный и торжественный, цвет восхода солнца и кардинальских мантий. За 1600 лет до н. э. в Древнем Египте и на острове Крит пурпуром окрашивали одежды. В Древней Ассирии и роскошной Византии пурпурный цвет был символом могущества и знатности. Римляне награждали победителя пурпурной лентой, и лишь сам император имел право облачаться в тогу такого цвета. Мореплаватели и купцы платили жизнью, добывая в далеких экзотических странах моллюсков, которые давали царственную краску. Но древние не подозревали главного: пурпур — не только и не столько цвет могущества и знатности, это цвет уникального светочувствительного вещества, дарующего способность видеть. Речь идет о зрительном пигменте, которому первооткрыватели присвоили звучное имя "зрительный пурпур". Сегодня он по-научному называется "родопсин".

В 1851 году немецкий физиолог Генрих Мюллер извлек из лягушачьего глаза сетчатку и просто, без всяких приборов, взглянул на нее. Она оказалась розовато-пурпурной. Однако это любопытное наблюдение не привлекло особого внимания ученых. Лишь через четверть века австриец Ференц Болль повторил опыт Мюллера и написал в короткой статье 1876 года: "Вытащенная из глаза розовая сетчатка на свету выцветает, становится белесой. Выцветание должно быть как-то непосредственно связано с процессом зрения". (Сегодня это явление называют "обесцвечивание".)

Статья Ф.Болля положила начало систематическому изучению зрительных пигментов. С тех пор и по сей день светочувствительный зрительный пурпур, или родопсин, остается одним из самых интересных и подробно изучаемых белков.

Электронная фотография палочек и колбочек: (1)— палочки, (2)— колбочкиА теперь короткая анатомическая справка. Глаз - это сфера, заполненная стекловидным телом. Ее заднюю внутреннюю поверхность выстилает сетчатка. Сетчатка никоим образом не фотопленка, а сложнейший нервный центр. Как говорил великий испанский гистолог конца XIX века Сантьяго Рамон-и-Кахал, сетчатка - это "часть мозга, помещенная в глаза". Наружный ее слой состоит из 120 миллионов палочек и от 4 до 6 миллионов колбочек. Палочки действительно похожи на палочки, точнее, на цилиндры, и они ответственны за сумеречное, черно-белое зрение. Они очень чувствительны к свету, но не способны различать цвета (вот почему говорится, что ночью все кошки серы), а днем глаз воспринимает все цвета видимого спектра. Отвечают за это уже не палочки, а колбочки сетчатки глаза, содержащие сине-, зелено- и красночувствительные зрительные пигменты.

Итак, мы возвращаемся к родопсину — пигменту, находящемуся в зрительных клетках глаза всех беспозвоночных и позвоночных животных и, конечно, человека. Фотохимические превращения родопсина интенсивно изучали со дня его открытия, но эти исследования стали особенно актуальны в последнее время.

Причины две: во-первых, научное любопытство, ибо именно азарт познания движет науку, во-вторых — практическая необходимость. Прежде всего эти знания нужны офтальмологии для лечения больных, а в будущем, вероятно, они понадобятся создателям высоких технологий. Так, подражая принципу работы светочувствительных белков, подобных родопсину, может быть, удастся создать молекулярные компьютеры.

Молекула родопсина содержит одну хромофорную группу (та, что поглощает свет), две олигосахаридные цепочки и водонерастворимый мембранный белок — опсин. Родопсин — первый мембранный белок животного происхождения, полную аминокислотную последовательность и топографию которого удалось расшифровать в начале 80-х годов XX века. (Это была работа академика Ю.А.Овчинникова и его сотрудников, которая была опубликована практически одновременно с работой американцев.) В начале же 2000-х годов американским и японским исследователям удалось методом рентгено-структурного анализа получить трехмерную структуру родопсина (рис. 3). Это было непросто, хотя его молекулярная масса сравнительно невелика — около 40 кДа, а полипептидная цепь состоит из 348 аминокислотных остатков.

Хромофорная группа всех без исключения зрительных пигментов человека и животных — это альдегид витамина А, или ретиналь. Важно, что из 16 его возможных изомерных форм в ходе эволюции только одна из них, а именно изогнутая 11-цис-изомерная форма, стала хромофорной группой зрительных пигментов. Хромофор расположен в центре молекулы родопсина и выполняет сразу несколько физиологических функций.

Во-первых, в зависимости от окружающих его аминокислотных остатков он обеспечивает функцию спектральной настройки. Дело в том, что зрительные пигменты животных (беспозвоночных и позвоночных) и человека способны поглощать свет от ультрафиолетовой (360 нм) до красной (620 нм) области спектра. Именно благодаря этому в сетчатке человека есть сине-, зелено-, и крас-ночувствительные колбочки, ответственные за цветовое зрение. Не будь спектральной настройки, не было бы и цветового зрения, а тогда и днем все кошки были бы серы. Большинство млекопитающих, в частности собаки, кошки и даже быки, практически лишены сине-, зелено-, и красночувствительных колбочек, и мир для них однотонный. Приматы же, то есть обезьяны и человек, под давлением жесткой необходимости видеть мир цветным, приобрели в ходе эволюции цветовое зрение. Если бы наши очень далекие предки обезьяны не смогли бы уверенно различать желтый банан на зеленом фоне листьев, они бы просто-напросто вымерли, и их гордый потомок Homo sapiens не появился бы на свет.

Вторая физиологическая функция 11-цис-ретиналя как хромофорной группы - это ее сверхбыстрая изомеризация, вызванная поглощением кванта света. Но об этом подробнее расскажем чуть позже.

И наконец, третья его функция в том, чтобы "держать и не пущать". 11-цис-ретиналь должен в темновом состоянии удерживать молекулу родопсина, чтобы она, не дай Бог, не запустила ложный зрительный акт. Эта третья важнейшая его функция - один из эффективных способов борьбы зрительной клетки с темновым тепловым "шумом". Используя технический язык, можно сказать, что зрительная клетка — это удивительно малошумящий и при этом высокочувствительный детектор света, то есть фактически счетчик одиночных фотонов. Для того чтобы фотоумножитель, сделанный руками человека, показал такие же характеристики, приходится помещать его в жидкий азот (- 196° С), а природный фотоумножитель — зрительная клетка — эффективно работает при температуре тела (36,6° С). В научной литературе эта третья функция формулируется так: 11-цис-ретиналь - мощный лиганд-антагонист родопсина как рецептора, связывающего G-белок (про G-белок и преобразование светового сигнала в зрительной клетке в биоэлектрический сигнал смотри во врезе).

Результат компьютерного моделирования подстройки 11-цис-ретиналя к белковому окружению. На картинке внизу видно, что один из аминокислотных остатков, (лейцин-266), сильно приближается к Р-иононовому кольцу 11-цис-ретиналя и удерживает его в энергетически невыгодном состоянии. Вероятно, это важно для последующей сверхбыстрой и эффективной изомеризации 11-цис-ретиналя при поглощении им кванта светаНе вдаваясь сейчас в подробности, скажем только, что в темноте этот мощный лиганд-антагонист препятствует запуску последующих ферментативных реакций в зрительной клетке, которые в конечном счете приводят к возникновению в ней сигнала. Функция 11-цис-ретиналя как лиганда-антагониста - одна из важнейших. Зрительный акт должен быть запущен квантом света, а не быть ложным. Если бы ложных запусков было много, то на их фоне зрительная клетка попросту не "увидела" бы кванта света, не различила бы его в темновых шумах, и ни о какой высокой световой чувствительности нельзя было бы и мечтать.

На субмолекулярном уровне все эти наиважнейшие физиологические функции 11-цис-ретиналя достигаются благодаря его тонкой, можно сказать, изощренной подстройке и "подгонке" к ближайшему белковому окружению в хромофорном центре молекулы родопсина. Совместно с профессором М.Холмуродовым, работающим в Объединенном институте ядерной физики в Дубне, и кандидатом биологических наук Т.Б.Фельдман из нашей лаборатории в Институте биохимической физики РАН им Н.М.Эмануэля мы в последнее время подробно исследовали взаимную "подстройку" конформационного состояния 11-цис-ретиналя и его белкового окружения в хромофорном центре родопсина.

Фототрансдукция

Фототрансдукция — это преобразование и усиление (почти в сто тысяч раз) светового сигнала в зрительной клетке, в результате которого возникает биоэлектрический сигнал.

Квант света поглощается хромофорной группой молекулы родопсина (11-цис-ретиналем) и изомеризует его в полностью-гранс-форму (см. об этом в статье). Этот переход вызывает перестройку белковой части молекулы, и такой родопсин приобретает способность взаимодействовать со следующим белком в цепи — ГТФ-связывающим белком. Его в научной литературе также называют G-белком, а в механизме фототрансдукции он получил название трансдуцин. Получается, что в темноте 11 -цис-ретиналь — это мощный лиганд-антагонист родопсина, который сам работает как типичный и классический рецептор, связывающий G-белок, то есть трансдуцин.

Активированный родопсином трансдуцин, в свою очередь, включает следующий белок — фосфодиэстеразу (ФДЭ). Это очень активный фермент, который с высокой скоростью разрушает внутриклеточный передатчик сигнала, циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ). Падение в цитоплазме концентрации цГМФ приводит к блокированию специфичных ионных каналов в клеточной мембране, через которую в темноте в клетку входили ионы натрия и кальция. Поскольку каналы заблокированы, на свету вход ионов прекращается и на клеточной мембране увеличивается электрический потенциал, то есть происходит гиперполяризация фоторецепторной клетки-палочки или колбочки. Гиперполяризация служит физиологическим ответом рецепторнои клетки на поглощение молекулой родопсина кванта света. Это и есть тот самый биоэлектрический сигнал, который распространяется от наружного сегмента до синаптического окончания зрительной клетки — палочки или колбочки.

Затем биоэлектрический сигнал через первый синапс передается нервным клеткам сетчатки, далее через второй синапс следующему слою нервных клеток, а уже от них по длинным отросткам, образующим зрительный нерв, в виде последовательности нервных импульсов в мозг для дальнейшей сложнейшей обработки зрительной информации. В результате этой обработки, которой может позавидовать самый сложный компьютер, в мозгу рождается "субъективный образ объективного внешнего мира". Следует отметить, что зрительные (фоторецепторные) и нервные клетки в сетчатке (части мозга, помещенной в глаз) расположены слоями, и вся сетчатка напоминает по своему строению пирожное "наполеон".

Усиление сигнала обеспечивают три этапа ферментативного каскада фото-трансдукции. На первом каждая возбужденная светом молекула родопсина активирует множество (до двухсот) молекул трансдуцина. На втором усиления не происходит: одна активированная молекула трансдуцина активирует одну молекулу фосфодиэстеразы. А вот на третьем этапе одна молекула фосфодиэстеразы вызывает распад до 1000 молекул цГМФ. С помощью такого механизма — каскада усиления светового сигнала — поглощение всего одного кванта света приводит к физиологическому зрительному сигналу.

Зрение начинается с изомеризации

Теперь очень коротко о том, что происходит с молекулой родопсина при поглощении кванта света. Фотопревращение родопсина включает собственно фотохимическую и последующие темновые, зависящие от температуры реакции. Здесь мы остановимся на фотохимии родопсина, поскольку именно в фотохимии проявляются его поистине уникальные свойства.

А что, собственно говоря, делает свет в зрении? Ответ теперь известен и вошел во все физиологические учебники. Свет в зрении - в этом невероятно сложном, многокомпонентном процессе, который начинается в зрительной клетке сетчатки глаза (а именно в хромофорном центре молекулы зрительного пигмента) и заканчивается опознанием зрительного образа в коре больших полушарий, - нужен только для того, чтобы изомеризовать 11-цис-ретиналь.

Все множество последующих событий и в самой зрительной клетке, и во всех нервных клетках сетчатки происходит без участия света. Он выполняет лишь триггерную, то есть спусковую, функцию. 11-цис-ретиналь - это спусковой курок, на который "нажимает" поглощенный квант света. А выстреливает уже сама зрительная клетка, в которой все заранее приготовлено, - она только ждет, чтобы курок был спущен.

Итак, единственная фотохимическая реакция в зрении, это цис-транс изомеризация хромофорной группы родопсина — 11-цис-ретиналя (рис. 6). И вот что важно: самый первый продукт после фотоизомеризации — фотородопсин — образуется с уникально высокой скоростью, менее чем за 100—200 фемтосекунд (1 фс = 10-15 с). И это означает, что само выпрямление полиеновой цепочки (изомеризация) должно происходить еще быстрее. Кроме того, реакция фотоизомеризации весьма эффективна: ее квантовый выход около 0,7, что для фотохимической реакции очень много.

Все последующие перестройки в молекуле родопсина, запущенные фотоизомеризацией, как уже говорилось, происходят без участия света. За несколько десятков пикосекунд (1 пс = 10-12 с) фотородопсин переходит в следующий продукт — батородопсин, а затем образуются следующие продукты превращения родопсина. Одно из последних конформационных состояний, которое образуется уже за миллисекунды (1 мс = 10-3 с), так называемый метародопсин II, запускает каскад биохимических реакций в зрительной клетке, приводящий к возникновению в ней физиологического зрительного сигнала.

Современная техника способна исследовать даже такие быстрые реакции, как образование фотородопсина, - это так называемая фемтосекундная химия, которой занимаются профессор О.М.Саркисов и его сотрудники в Институте химической физики РАН им. Н.Н.Семенова. Совместно мы изучаем особенности этих сверхбыстрых фотохимических реакций (рис. 7). Из данных, полученных нами, видно, что образование фотородопсина происходит не дольше чем за 200 фс. Такая уникальная скорость возможна только потому, что 11-цис-ретиналь сидит в хромофорном центре молекулы родопсина, плотно "пригнанный" к белковому окружению. Тот же 11-цис-ретиналь в спиртовом растворе, то есть вне белкового окружения, фотоизомеризуется на два порядка медленнее и раз в пять менее эффективно.

Спрашивается, зачем в молекулярном механизме зрения требуется столь быстрая фотоизомеризация 11-цис-ретиналя? В чем ее физический и физиологический смысл? Ведь сам зрительный сигнал, который возникает в зрительной клетке и затем передается следующей нервной клетке сетчатки, на много порядков медленнее, чем реакция фотоизомеризации, — так зрительный сигнал палочки формируется за десятки или даже сотни миллисекунд.

Эволюция не допускает случайных вещей. Физический смысл столь быстрой и эффективной реакции хромофорной группы родопсина состоит в том, чтобы энергия поглощенного кванта света максимально использовалась именно на "полезную" фотоизомеризацию 11-цис-ретиналя, а не рассеялась в тепло или не высветилась в виде флуоресценции. Чтобы конкурировать с этими "паразитными" реакциями, и нужны столь высокая скорость и эффективность фотоизомеризации.

Ответ этот, безусловно, верный и общепринятый, но, быть может, не единственный. Над еще одним возможным физиологическим смыслом уникальной скорости фотоизомеризации хромофорной группы в молекуле зрительного пигмента мы сейчас думаем и работаем.

Свет и парадокс зрения

Фотобиологический парадокс зрения состоит в том, что свет несет глазу не только зрительную информацию, но и опасность. Почему? А потому, что компоненты молекулярной машинерии зрения крайне уязвимы для повреждающего действия света. Как известно, за все надо платить. Платой за совершенство механизма зрения, когда одного поглощенного кванта света палочке достаточно, чтобы в ней возник физиологический, зрительный сигнал, становится ее фотоуязвимость. Причина опасности — реакции фотоокисления.

Уязвимость определяется совокупностью по крайней мере трех факторов, каждый из которых необходим и достаточен для инициации и развития реакции фотоокисления. Первый фактор — фотосенсибилизаторы, поглощающие свет и запускающие эту реакцию. К фотосенсибилизаторам относится и сам ретиналь, и продукты его превращения. Второй фактор — кислород, которым сетчатка прекрасно обеспечена, так же хорошо, как и мозг. И третий — присутствие легко окисляющихся субстратов: белков и липидов мембран зрительных клеток.

Казалось бы, при этих условиях палочки должны были бы "сгореть" от света. Но если бы это было так, то, лишь однажды взглянув на яркий солнечный мир, мы бы ослепли. Однако этого не происходит. Потому не происходит, что в ходе эволюции парадокс зрения был успешно разрешен. Суть в том, что сформировались две зависимые друг от друга функциональные системы глаза: собственно зрительная рецепция и надежная система защиты от опасности светового повреждения.

Понимание природы солнечности глаза, а именно механизмов восприятия и преобразования энергии поглощенного света и молекулярных механизмов его повреждающего действия, позволяет понять причины заболеваний сетчатки глаза и попытаться найти способы профилактики и лечения.

В частности, такие исследования привели нас более двадцати лет назад к практическому результату. Было создано новое поколение искусственных окрашенных хрусталиков, которые надежно защищают сетчатку от фотоповреждения после удаления катарактального хрусталика.

Что же входит в многоуровневую систему защиты глаза от света? Она состоит из нескольких линий обороны: это постоянное обновление наружных сегментов (частей) палочек и колбочек, богатый набор антиоксидантов и, наконец, оптические среды глаза, работающие как светофильтры. Важнейшую роль здесь играет хрусталик, который служит не только фокусирующей линзой, но и светофильтром.

Фотолиз родопсина — цепочка биохимических превращений, которую запускает поглощенный цис-ретиналем квант светаУ многих животных, живущих в яркой световой среде, хрусталик интенсивно желтый от рождения. Такой окрашенный хрусталик отсекает не только ультрафиолетовый, но частично и фиолетово-синий свет — именно они наиболее опасны для сетчатки. У человека в детском и юношеском возрасте хрусталик практически бесцветный. Он хорошо пропускает свет в коротковолновой области видимого спектра (400—500 нм), но, естественно, задерживает ультрафиолет. С возрастом хрусталик желтеет (поэтому в молодости небо действительно голубее). Благодаря этому перед сетчаткой появляется дополнительный желтый светофильтр. Результатом наших исследований как раз и стал желтый хрусталик, о котором шла речь. Уже более одного миллиона трехсот тысяч таких искусственных хрусталиков имплантировано в России во время операций по удалению катаракты (когда заменяют собственный мутный хрусталик пациента).

Как известно, с возрастом у многих людей начинаются заболевания сетчатки — это одна из наиболее "горячих точек" современной офтальмологии. Во многих развитых странах — в США, в Европе, в том числе и в России, эти болезни приводят к частичной, а иногда и полной слепоте и инвалидности по зрению. Возрастные заболевания сетчатки становятся серьезной социальной проблемой. Согласно многим научным публикациям, свет выступает в этих заболеваниях как усугубляющий фактор. Поэтому исследование механизмов повреждающего действия света на сетчатку - важная и актуальная задача.

В нашей лаборатории мы получили новые данные о фотоповреждении родопсина, которые будут опубликованы в научных журналах практически одновременно с этой статьей. Оказалось, что видимый свет может повреждать молекулу родопсина. А раз так, это может привести к нарушению темновой адаптации - фундаментального физиологического свойства зрительной системы, а именно ее способности привыкать к темноте после пребывания на ярком свету.

Виновником повреждения молекулы родопсина может стать сам ретиналь. Дело в том, что на последней стадии фотопревращения родопсина  происходит высвобождение его хромофорной группы — полностью-гранс-ретиналь выходит из белковой части молекулы и переходит в липидную фазу мембраны. В норме этот полностью-гранс-ретиналь из наружной части палочки сетчатки быстро удаляется. Для этого существует специальный биохимический механизм. Однако вполне возможны ситуации, например, при избыточном обесцвечивании родопсина (когда он из пурпурного становится желтоватым) или при некоторых заболеваниях сетчатки, когда ретиналь остается в мембране палочки и накапливается там. Вот тогда он легко взаимодействует в этой самой мембране с аминогруппами липидов и родопсина. Если это произошло, то под действием света ретиналь будет проявлять свои фотосенсибилизирующие свойства, вызывая повреждение липидов и зрительного пигмента родопсина. Мы экспериментально показали, что при облучении ярким видимым светом нарушается важнейшая функция зрительного пигмента - его способность к регенерации, то есть восстановлению исходного темнового состояния. Это свидетельствует о том, что портится его белковая структура.

Конечно, эксперимент мы проводили in vitro, но в организме избыточное накопление полностью-гранс-ретиналя в мембране зрительной клетки вполне может служить фактором риска, с которым связано усугубляющее действие света при развитии дегенеративных заболеваний сетчатки.

Исследуя молекулярные механизмы зрения, мы вновь убеждаемся в справедливости слов академика С.И.Вавилова: "Глаз нельзя понять, не зная Солнца". Не зная физических характеристик солнечного света, доходящего до Земли, не зная особенностей световой экологии животных и человека, нельзя понять ни молекулярной машинерии нормального акта зрения, ни природы нарушения этого механизма. Между тем, все это безумно интересно и, несомненно, полезно для медицины. А в будущем, может быть, и для молекулярной электроники.